La chromatographie sur colonne

 

    Il s’agit d’une méthode de séparation des constituants d’un mélange par migration dans un dispositif constitué de deux phases :

- la phase stationnaire : support solide

- la phase mobile : le solvant.

 

Si on utilise souvent cette technique et sa variante plus performante (HPLC : chromatographie liquide haute performance) pour l’analyse de produits, la purification de produits directement après une synthèse est également possible.

 

I.                 Infos générales.

 

On utilise le plus souvent la silice (SiO2) comme adsorbant à raison d’environ 30g par gramme de produit à chromatographier.

L’alumine est également utilisable mais peut induire des réactions parasites notamment avec l’acétone (condensation aldolique).

La granulométrie des grains sera typiquement comprise entre 50 et 200 μm.

 

II.             La polarité.

 

On retrouve ici le même type de considérations que pour la CCM : les composés les plus retenus sont les composés polaires.

La phase mobile est en générale un mélange de deux solvants : l’un polaire, l’autre apolaire. Au cours de la séparation, et après avoir récupéré les produits apolaires, on pourra augmenter progressivement la polarité de l’éluant afin de récupérer les produits les plus polaire. On réalise alors un gradient d’élution.

 

III.         Le remplissage de la colonne.

 

C’est l’étape clé pour une bonne séparation. Malheureusement, c’est également la plus délicate car le remplissage doit être le plus homogène possible et exempt de bulle d'air. Les surfaces inférieure et supérieure de l'adsorbant doivent être parfaitement horizontales.

Et si c’est simple à dire, dans la pratique, la réalisation d’une bonne colonne peut passer par quelques échecs…

 

1)      Le remplissage par voie humide.

 

On prépare dans un bécher un mélange homogène de l'adsorbant et du moins polaire des solvants utilisé pour le développement en ajoutant par petites quantités l'adsorbant dans le solvant pour obtenir une bouillie suffisamment fluide pour couler facilement.

A l'aide d'un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que l'adsorbant qui se dépose progressivement forme une couche d'environ 2 cm. On tapote les parois de la colonne pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre alors le robinet pour que le solvant s'écoule lentement et on poursuit l'addition de la bouillie par portions successives. Quand tout l'adsorbant est introduit, on laisse décanter jusqu'à ce que le liquide qui surnage soit limpide.

Pendant l'opération, on veillera à ce que le niveau de solvant soit toujours supérieur à celui de l'adsorbant.

 

2)      Le remplissage par voie sèche.

 

La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est ajouté en portions successives dans la colonne à l'aide d'un entonnoir ; pendant l'addition, on frappe continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la première portion forme une couche d'environ 2 cm, on ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant. On termine comme précédemment.

 

IV.         Le dépôt du mélange à séparer.

 

Avant de réaliser le dépôt, on ajustera le niveau du solvant pour qu’il affleure à la surface de l’adsorbant.

On déposera les liquides tels quels, à la pipette, en s’aidant des parois de la colonne.

Adsorber uniformément le composé en sommet de colonne en laissant couler un peu d’éluant.

Pour déposer les mélanges solides, il est possible de les dissoudre dans la quantité minimale de solvant d’élution.

Il est aussi possible de les absorber sur 5 à 10 g de silice dans un solvant adéquat et de déposer le solide obtenu après évaporation au sommet de la colonne.

 

V.             Alimentation de la colonne en éluant.

 

On fera attention à ne pas perturber la surface du solvant dans la colonne au cours des ajouts.

On peut utiliser une pissette ou une pipette Pasteur et s’aider des parois de la colonne.

Une ampoule de coulée (ou une ampoule à décanter) permet d’assurer une alimentation continue en goutte-à-goutte.

Il ne faut jamais attendre que la colonne soit presque à sec pour la réalimenter en éluant. Il apparaîtrait alors des fissures dans la colonne et l’élution se transformerait en simple ruissellement.

L’adsorbant devra toujours être surmonté d’au moins 2 cm de solvant.

Pour la plupart des opérations, une vitesse de 5 à 50 gouttes à la minute convient (la limite inférieure correspond aux séparations difficiles).

 

VI.         Récupération des fractions.

 

 

On fera des fractions de l’ordre de 10 à 50 ml suivant le volume de la colonne.

On les récupérera dans des récipients numérotés. L’analyse se fera par CCM et les fractions de même composition seront rassemblées.

 

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